六、痰培养检查法
(一)痰标本采集
新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药2～3天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，咳痰3～5毫升留作培养检查。
如需送上级实验室检查，应在标准痰瓶中，加入与标本等体积的防腐液［06%溴化十六烷基吡啶(CPB)的2%氯化钠(NaCl)液］，密封保存。此标本应及时送交上级实验室。防腐处理后，痰标本可在室温下短期存放。但仍以4℃保存为宜，存放时间不应超过2周。
(二)分离培养基
分离培养采用酸性罗氏培养基和丙酮酸钠培养基。
1酸性改良罗氏培养基：
成份：
基础液 谷氨酸钠(纯度99%以上) 〖WB〗7.2克
磷酸二氢钾 14.0克
硫酸镁0.24克
柠檬酸镁 0.6克
丙三醇 12毫升
蒸馏水 600毫升
无机盐试剂应采用化学纯(CP)试剂
新鲜鸡卵液 1000毫升
2%孔雀绿水溶液 20毫升
制备方法：
1)基础液制备：量取蒸馏水600毫升。加入各无机盐成份、谷氨酸钠和丙三醇，100℃加热30 分钟，冷却。
2)新鲜鸡卵液制备：洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70%乙醇或其它稀释消毒液中20～30分钟。取出，擦干,开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。
3)将600毫升基础液和1000毫升新鲜鸡卵液混匀。加2%孔雀绿水溶液20毫升，混匀，静置1小时后，分装6毫升至标准螺旋盖培养管或7毫升于中试管(15～18×180毫米)中。双层放置于搁架中，经培养基蒸汽凝固灭菌器，85℃灭菌50分钟。培养基斜面应占试管的2/3。灭菌后，37℃无菌试验 24小时。制成的培养基斜面应颜色鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。无菌试验后，新制备的培养基应4℃避光保存，一月内使用。
2丙酮酸钠培养基：
基础液 谷氨酸钠(纯度99%以上) 7.2克
磷酸二氢钾 2.4克
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.24克
柠檬酸镁 0.6克
丙酮酸钠 1.6克
葡萄糖 4.0克
蒸馏水 600毫升
无机盐和有机物试剂均应采用化学纯(CP)试剂
新鲜鸡卵液 1000毫升
2%孔雀绿水溶液 20毫升
制备方法：
基础液制备：除冷却后加入葡萄糖外，丙酮酸钠培养基制备同上。
(三)前处理
视痰标本性状，加1～2倍体积4%氢氧化钠(NaOH)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡2～3分钟 ，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟 。样本数较多时，应分批处理。
(四)接种
吸取经前处理后的痰液01毫升，均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基，同时可补充接种一支丙酮酸钠培养基，以利于牛分支杆菌和一些耐药结核分支杆菌的生长。或同时接种酸性罗氏和丙酮酸钠培养基各1支。
接种后，37℃平卧放置斜面24小时。然后，拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37℃继续培养。
含溴化十六烷基吡啶(CPB)防腐的痰标本，在接种前需用生理盐水或蒸馏水定溶至30毫升，3 000xg离心30分钟，再以生理盐水或蒸馏水洗涤沉渣2次。低温时，因溴化十六烷基吡啶(CPB)产生沉淀，需先将样本置37℃，使沉淀重新完全溶解后，再洗涤离心。同上，接种0.1ml 沉渣。
(五)结果与报告
1抗酸杆菌生长报告：接种后第3天、第7天各观察一次。3天发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长抗酸杆菌。
以后，每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告抗酸杆菌生长。培养阴性结果须在满8周时，即第9周开始时仍未见菌落者方可报告。
观察时发现非抗酸杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应在2～5%范围内。污染率高，提示培养基灭菌不佳，标本处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。
培养结果报告方式：
抗酸杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长。
抗酸杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的1/4。
抗酸杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的1/2。
抗酸杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的3/4。
抗酸杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满全斜面。
抗酸杆菌培养阴性应以"(培养阴性)"报告，不能以"(-)"表示。
菌落生长不足以斜面面积1/4时，实报菌落数。
污染菌生长程度报告方式：
C1+：污染菌占培养基斜面1/4以下者。
C2+：污染菌占培养基斜面1/2以下者。
C3+：污染菌占培养基斜面3/4以下者。
C4+：污染菌占培养基全斜面。
LQ：培养基液化。
若抗酸杆菌和污染同时存在于同一斜面上，应同时报告。
2鉴别培养基：在分离培养基上缓慢生长的抗酸杆菌，需经PNB和TCH鉴别培养后，方可初鉴为结核分支杆菌、牛分支杆菌或非结核分支杆菌。
制备：
1)对硝基苯甲酸(PNB)培养基：二甲基甲酰胺少量溶解PNB后，加入改良罗氏培养基的基础液中，使整个培养基终浓度为05毫克/毫升，培养基凝固灭菌同前。
2)噻吩2羧酸肼(TCH)培养基：5毫克TCH溶于10毫升蒸馏水中，取1毫升加入100毫升罗氏培养基基础液中，使整个培养基终浓度为5微克/毫升，培养基凝固灭菌同前。
接种：
于玻璃研磨器中研磨临床分离培养物成10-2毫克/毫升均匀菌液，接种0.1毫升于上述两种鉴别培养基上和对照改良罗氏培养基上。37℃培养，每周观察一次，四周后报告生长结果。
鉴定：
在药物敏感性测验同时，进行PNB和TCH鉴别培养基测验，可提供临床分离株的初步种的鉴定结 果。需要时，可辅以硝酸还原试验、烟酸试验和耐68℃热触酶试验。或提交省参比实验室鉴定。
临床分离株种的初步鉴定
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