鹿茸液对CHF大鼠影响的实验研究

关键词　鹿茸液、充血性心力衰竭、心功能、水通道蛋白2

摘要

　　目的　本研究评价了中药鹿茸液对CHF大鼠心功能、心肌细胞凋亡及I、III型胶原和AQP2的影响，初步探讨鹿茸液改善心功能的作用机制和途径，为其进一步的临床应用提供了科学依据。

　　方法　动物实验采用结扎大鼠冠状动脉前降支法制作了心肌梗死后形成的CHF模型。观察了鹿茸液对慢性充血性心力衰竭大鼠的强心作用，以超声心动测量大鼠心功能变化，同时采用原位杂交法探讨心肌细胞凋亡及I、III型胶原和AQP2的影响。

　　结果

　　(1)
造模后CHF大鼠心脏泵功能出现明显下降，鹿茸液能够明显改善CHF大鼠心脏泵功能，可提高EF、FS%、CO，较心衰值相比有显著统计学意义（P＜0.05），鹿茸液中剂量组和卡托普利组在改善EF、FS%方面相比无统计学差异（P＞0.05），鹿茸液中剂量组优于高剂量组，高剂量组优于低剂量组。

　　(2)
鹿茸液各剂量组CHF大鼠心肌细胞凋亡的表达与模型组相比较低，二者具有统计学差异（P＜0.05），鹿茸液中剂量组和卡托普利组之间无统计学差异（P＞0.05），并且鹿茸液中剂量组优于高剂量组，高剂量组优于低剂量组。

　　(3)
鹿茸液各组I、III型胶原表达较模型组低，相比具有统计学差异（P＜0.05），鹿茸液中剂量组和卡托普利组之间无统计学差异（P＞0.05），并且鹿茸液中剂量组优于高剂量组，高剂量组优于低剂量组。

　　(4)
模型组大鼠肾脏髓质集合管AQP2mRNA表达与正常组相比显著增高，鹿茸液中剂量组和卡托普利组与模型组相比，AQP2mRNA的表达明显下调，但鹿茸液中剂量组比卡托普利组AQP2mRNA的表达高。鹿茸液高剂量和低剂量组与模型组相比，AQP2mRNA的表达也有所下调，但其下调程度远不如鹿茸液中剂量组和卡托普利组。提示鹿茸液能减少CHF模型大鼠AQP2mRNA的表达。

　　结论　鹿茸液对慢性心衰大鼠的左室形态、心功能有改善作用；能够减少心肌细胞凋亡，减少I、III型胶原沉淀，并且能降低CHF大鼠AQP2mRNA的表达。从而抑制左室重构。鹿茸液对慢性心力衰竭具有良好的疗效，并能延缓和制止心衰的发展进程，改善预后，疗效确切，具有良好的临床研究前景。

慢性心力衰竭（CHF）是多种心血管疾病走向死亡的最后转归，随着人口老龄化进程的加快，CHF的发病率正逐年升高。目前我国CHF患病率为0.9%，35～75岁人群中有400万心衰患者。5年存活率同恶性肿瘤相仿。近年来，随着国内外分子生物学的发展，认识到CHF是一种临床征候群，由心脏疾患引起的心脏排血量降低，静脉压增高，神经内分泌系统激活，并伴有心脏分子结构异常和导致衰竭心脏进行性恶化，而心室重构是CHF病理生理学发展的重要机制。目前的治疗方法并不令人满意。

中医认为心衰病机以正虚为本，以邪实为标，其中本虚又以气虚阳虚多见。中药治疗心衰取得了良好的疗效。鹿茸为传统中药之补阳药，具有补肾阳、益精血、强筋骨的作用。现代药理学研究证实，鹿茸的有效成分能促进生长发育、提高机体的工作能力、减轻疲劳，改善蛋白质代谢障碍和改善能量代谢，中等剂量的鹿茸能引起心率加快，每分输出量增加。

1　材料与方法

1.1　动物模型的制备

采用结扎大鼠左冠状动脉前降支法造成心肌梗死后心衰的模型。大鼠麻醉后开胸暴露心脏，于左心耳下缘3mm处结扎左冠状动脉前降支，以心电图出现ST段弓背向上抬高为急性心肌梗死模型的成功标志。术后常规饲养。3周之后检测超声进行心功能检查，以EF值降至60%以下为心衰模型成功标志。

1.2　动物分组及给药

模型成功后，将大鼠随机分为以下6组：连续灌胃给药4周，分别在第2、第4周时检测心功能指标。

鹿茸提取物高剂量组：给与鹿茸提取物5g kg^-1 ·d^-1；

鹿茸提取物中剂量组：给与鹿茸提取物2.5g kg^-1 ·d^-1；

鹿茸提取物低剂量组：给与鹿茸提取物1.25g kg^-1 ·d^-1；

卡托普利组：给与卡托普利50mg kg^-1 ·d^-1；

模型组：；给与蒸馏水10ml kg^-1 ·d^-1；

正常组：不进行药物干预，常规饲养，给与蒸馏水10ml kg^-1 ·d^-1；

1.3　心功能超声检测方法

参照文献方法，动物麻醉，取平卧位，剪去胸前区毛，涂耦合剂。采用二位超声心动图，选用9
MHz高频矩阵探头，垂直于左胸壁，并与胸骨成10º～30º夹角，显示心脏沿二尖瓣口至心尖方向的左室长轴像。于左室内径最大处(即乳头肌水平)显示M型超声图像，测量射血分数(EF)，心输出量(CO)和左室短轴缩短率(FS)
，取3个心动周期平均值记录数据。

1.4　心肌细胞凋亡的检测及半定量分析

原位细胞凋亡检测试剂盒TUNEL（POD）编号TBD2020POD，购于自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，按说明书操作。

结果判断：棕黄色或棕褐色细胞核为凋亡细胞，蓝紫色为非凋亡细胞；阴性对照片无棕黄色着色。在200倍光镜下随机选取5个无重叠视野，计算在100个细胞中的凋亡细胞数，以平均计数阳性细胞核数所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(apoptotic
index, AI)。

1.5　原位杂交心肌I、III型胶原检测

采用Collagen I 大鼠 mRNA原位杂交DIG染色系统试剂盒，编号FISH2005CO，Collagen III 大鼠
mRNA原位杂交DIG染色系统试剂盒，编号FISH2005CP，购于自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，按照说明书要求进行。

设计大鼠I
型胶原DNA序列如下：(1) 5’ --- GGCCA CCGCC CTCCT GACGC ACGGC CAAGA ---3’
；(2) 5’ ---ACTTC AGCTT CCTGC CCCAG CCACC TCAAG---3’
；III型胶原DNA序列：(1) 5’ --- GGTCC AGTCT CCCCA CCTCC TCCAG CAG ---3’
；(2) 5’ ---GGGCA CCTCT TTCTC CTTTA GCACC TGG---3’。

结果判断：光学显微镜下观察，细胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应，胞核为蓝色。在200倍光镜下随机选取5个无重叠视野，计算阳性细胞的个数，取其平均值。

1.6　原位杂交AQP2检测

采用AQP2多点标记的DIG（地高辛）探针原位杂交基本的实验方，探针序列：5’-TTGTA GAGGA GGGAA
CCGAT GATGG CG适合于MAqp2（mRNA），ISH DIG Kit
编号：aqp2008fish，购于自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，按照说明书要求进行。每例取10张阳性染色切片，在20х10光镜下对每张切片阳性细胞进行计数，取其平均值。

1.7　统计学方法

统计学方法采用SPSS13统计软件，计量资料采用均数±标准差（

）进行统计描述，两组间用T检验，多组间用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2　结果

2.1　鹿茸液对CHF大鼠心功能的影响

给药2周后鹿茸高、中剂量组、西药卡托普利组的EF、FS值与心衰值相比均有显著性改善（P＜0.01），给药4周后其EF、FS值继续呈现升高趋势。给药4周后鹿茸中剂量组的CO有提高（P＜0.05），其他各组均无统计学差异。

表1　每分输出量CO.

	正常值	心衰值	给药2周	给药4周
高剂量	0.079±0.007	0.053±0.016	0.063±0.010	0.074±0.019
中剂量	0.074±0.010	0.056±0.009	0.067±0.009	0.072±0.014^#
低剂量	0.078±0.010	0.059±0.016	0.062±0.012	0.062±0.003
西药组	0.076±0.008	0.060±0.010	0.068±0.009	0.061±0.010
模型组	0.076±0.009	0.060±0.017	0.062±0.012	0.062±0.015
正常组	0.081±0.011	0.060±0.013	0.067±0.010	0.068±0.015

注：与同期模型组相比*P＜0.05 **P＜0.01；与本组心衰值相比#P＜0.05 ##P＜0.01；与同期正常组相比△P＜0.05
△△P＜0.01

表2　左室射血分数EF

	正常值	心衰值	给药2周	给药4周
高剂量	79.24±3.55	57.41±5.94	65.58±2.82*^##△△	68.31±4.76*^##△△
中剂量	79.05±1.61	55.94±2.47	63.63±4.06^##△△	68.42±3.79**^##△△
低剂量	81.74±2.51	57.21±3.82	61.16±4.13^△△	61.32±4.58^△△
西药组	78.17±2.49	58.41±4.04	66.74±2.51*^##△△	71.76±4.02**^##△
模型组	79.13±2.55	57.66±3.91	60.26±3.98^△△	60.03±3.95^△△
正常组	81.73±1.48	79.31±3.58	77.94±2.23**	79.13±1.59**

注：与同期模型组相比*P＜0.05 **P＜0.01；与本组心衰值相比#P＜0.05 ##P＜0.01；与同期正常组相比△P＜0.05
△△P＜0.01

表3　左室短轴收缩率FS

	正常值	心衰值	给药2周	给药4周
高剂量	40.86±3.51	25.45±3.33	29.84±2.04^#△△	31.92±3.41*^##△△
中剂量	40.29±1.47	23.88±1.46	28.70±2.63^##△△	31.71±3.18**^##△△
低剂量	43.67±2.24	24.69±2.20	26.55±2.56^△△	27.49±3.20^△△
西药组	39.75±2.35	25.18±2.27	30.75±1.73**^##△△	34.53±3.13**^##△△
模型组	41.25±3.46	24.93±2.32	26.85±2.14^△△	26.41±2.38^△△
正常组	43.30±1.52	41.60±3.88	39.63±2.01**	40.72±1.52**^△△

注：与同期模型组相比*P＜0.05 **P＜0.01；与本组心衰值相比#P＜0.05 ##P＜0.01；与同期正常组相比△P＜0.05
△△P＜0.01

2.2　对心肌细胞凋亡指数（AI）的影响

模型组可见到大量黄褐色凋亡细胞，鹿茸液中剂量组和卡托普利组可偶见凋亡细胞染色，两者之间凋亡指数无差异（P＞0.05），但与模型组相比差异显著（P＜0.01）；鹿茸液高剂量组和低剂量组凋亡细胞指数较模型组小，但高于鹿茸中剂量组和卡托普利组，空白组看不到凋亡细胞染色。

表4　心肌凋亡指数（AI）比较（%，）

组别	例数	AI (%)
鹿茸液高剂量组	11	21.67±5.06*
鹿茸液中剂量组	11	3.25±1.04**
鹿茸液低剂量组	11	40.25±6.17*
卡托普利组	10	1.08±0.14**
模型组	10	68.76±9.27
空白组	7	/

注：与同期模型组相比*P＜0.05 **P＜0.01

2.3　对胶原I、III含量的影响

在普通光学显微镜下观察，可见模型组心肌细胞束的间隙增宽，心肌胞束之间可观察到大量条索状，细胞浆显棕黄色颗粒的阳性反应，胞核为蓝色，分布也不均匀。鹿茸液中剂量组和卡托普利组大鼠心肌组织情况明显改善，心肌纤维化程度较模型组大鼠明显减轻（P＜0.01）。鹿茸液高剂量组、低剂量组胶原合成情况情况较模型组也有减低(P＜0.05)，胶原纤维细胞个数度较之明显减轻，但仍高于鹿茸液中剂量和卡托普利组的胶原计数。

表5　胶原I、胶原III计数（个，）

组别	例数	胶原I计数	胶原III计数
鹿茸液高剂量组	11	21.67±6.56*	7.58±1.27
鹿茸液中剂量组	11	15.25±4.82.**	5.63±2.78
鹿茸液低剂量组	11	26.25±7.25*	9.18±2.67
卡托普利组	10	10.08±3.56**	4.16±1.76
模型组	10	34.76±9.27	12.24±2.32
空白组	7	1.5±0.75	1.2±0.35

注：与同期模型组相比*P＜0.05 **P＜0.01

2.4　AQP2mRNA的阳性细胞数

正常对照组大鼠肾脏纵剖面上肾小球未见染色，细胞外基质及毛细血管未见染色。模型组的肾脏外髓质可见大部分集合管管腔内壁细胞被染成比正常组更深的棕黄色，说明其AQP2mRNA的表达比正常组强。通过半定量分析可得出：模型组大鼠AQP2mRNA表达显著高于其它组（P＜0.01），卡托普利组和鹿茸液中剂量组相比，其AQP2mRNA的表达明显下调，且有统计学意义（P＜0.05）。鹿茸液高剂量和低剂量组AQP2mRNA的表达比中剂量组和卡托普利组高，且具有统计学意义（P＜0.05），但高剂量组和低剂量组之间并无统计学差异（P＞0.05）。

表6　AQP2mRNA的阳性细胞数( )

组别	例数	AQP2mRNA
模型组	10	0.889±0.061^##
鹿茸液高剂量组	11	0.619±0.082**^△△##
鹿茸液中剂量组	11	0.400±0.051**^△△##
鹿茸液低剂量组	11	0.677±0.080**^△△##
卡托普利组	10	0.282±0.052**^△△##
正常对照组	7	0.137±0.035^##

注：与模型组相比*P＜0.05 **P＜0.01；与卡托普利组相比^#P＜0.05
^##P＜0.01；与正常组相比^△P＜0.05
^△△P＜0.01

3　讨论

心衰时血流动力学紊乱，心脏超负荷，能量代谢障碍，加之神经内分泌激素调节的激活，各种细胞因子的分泌，反射性引起心肌的收缩力加强，更加重了心脏的负荷和能量供应的短缺，恶性循环必然降低心功能。胶原是心脏细胞外基质最主要的成分。当心肌胶原含量高于正常水平2～3倍时，只会引起轻度顺应性减低；而一旦胶原含量稍低于正常水平，或者Ⅰ／Ⅲ型胶原比值下降、胶原交联程度降低，特别是在心肌梗死后，将会导致左室扩张、室壁瘤、心脏破裂等严重后果。本研究显示，鹿茸液对慢性心衰大鼠心功能有改善作用；能够减少心肌细胞凋亡，减少I、III型胶原沉淀，从而抑制左室重构。鹿茸液对慢性心力衰竭具有良好的疗效，并能延缓和制止心衰的发展进程，改善预后，疗效确切，具有良好的临床研究前景。

水潴留则是CHF的最重要病理生理变化之一，也是心源性水肿的发病机制，同时还是CHF出现症状的的重要原因，并可导致心功能进一步受损。在CHF水潴留机制的研究中，肾脏是水潴留的中心环节，受血管加压素调节的AQP2更是其关键性蛋白。我们的实验中发现可使AQP2mRNA的表达减少，以达到纠正心力衰竭的目的，但具体机制目前尚不清楚，仍需进一步研究。

参考文献（略）

附图